Flüssige Biopsien zur Diagnose von Krebs
Schreiben in Entdeckungsmedizin 2015 geben Labgaa und Mitautoren Folgendes zur konventionellen Tumorbiopsie an:
Aus offensichtlichen Gründen ist es schwierig, die Tumorentwicklung durch sequentielle Biopsien zu überwachen. Außerdem spiegelt die Biopsie nur einen einzelnen Punkt des Tumors wider und stellt daher wahrscheinlich nicht das gesamte Spektrum somatischer Mutationen bei großen Tumoren dar. Eine Alternative wäre die Gewinnung mehrerer Biopsien für denselben Tumor, aber diese Option scheint weder realistisch noch genau zu sein. "
Bei der Flüssigkeitsbiopsie werden zirkulierende DNA (ctDNA) und andere Tumornebenprodukte in Blutproben von Krebspatienten gemessen. Dieser neu entstehende diagnostische Ansatz verspricht, schnell, nicht invasiv und kostengünstig zu sein.
Geschichte der Flüssigbiopsie
1948 identifizierten Mandel und Métais, zwei französische Forscher, erstmals ctDNA im Blut gesunder Menschen. Diese Entdeckung war seiner Zeit voraus und erst Jahrzehnte später wurde ctDNA weiter erforscht.1977 identifizierten Leon und Kollegen erstmals erhöhte Mengen an ctDNA im Blut von Krebspatienten. Bis 1989 identifizierten Stroun und Kollegen neoplastische (d. H. Krebs) Merkmale im Blut. Nach diesen Entdeckungen identifizierten mehrere andere Gruppen spezifische Mutationen in Tumorsuppressoren und Onkogenen, Mikrosatelliteninstabilität und DNA-Methylierung, was bewies, dass ctDNA von Tumoren in den Kreislauf freigesetzt wird.
Obwohl wir wissen, dass von Tumorzellen stammende ctDNA im Blut zirkuliert, sind der Ursprung, die Freisetzungsrate und der Freisetzungsmechanismus dieser DNA unklar, was zu widersprüchlichen Ergebnissen führt. Einige Untersuchungen legen nahe, dass mehr bösartige Tumore mehr tote Krebszellen enthalten und mehr ctDNA freisetzen. Einige Untersuchungen legen jedoch nahe, dass alle Zellen ctDNA freisetzen. Dennoch ist es wahrscheinlich, dass Krebstumoren erhöhte Mengen an ctDNA ins Blut abgeben, was ctDNA zu einem guten Biomarker für Krebs macht.
Aufgrund der starken Fragmentierung und niedrigen Konzentrationen im Blut ist ctDNA schwer zu isolieren und zu analysieren. Es gibt eine Diskrepanz der ctDNA-Konzentrationen zwischen Serum- und Plasmaproben. Anscheinend ist Blutserum anstelle von Blutplasma eine bessere Quelle für ctDNA. In einer Studie von Umetani und Kollegen wurde festgestellt, dass die ctDNA-Konzentrationen im Plasma im Vergleich zum Serum aufgrund eines möglichen Verlusts an zirkulierender DNA während der Reinigung konstant niedrig sind, da die Gerinnung und andere Proteine während der Probenvorbereitung eliminiert werden.
Nach Ansicht von Heitzer und Kollegen müssen hier einige spezifische Probleme gelöst werden, um das diagnostische Potenzial von ctDNA auszuschöpfen:
"Erstens müssen voranalytische Verfahren standardisiert werden. Die Auswahl einer Isolierungsmethode, die die Extraktion einer ausreichenden Menge hochwertiger DNA sicherstellt, ist von entscheidender Bedeutung, und es wurde gezeigt, dass voranalytische Faktoren bei der Blutentnahme und -verarbeitung die DNA-Ausbeute stark beeinflussen können. Zweitens ist eines der wichtigsten Probleme das Fehlen einer Harmonisierung der Quantifizierungsmethoden: Verschiedene Quantifizierungsmethoden führen zu unterschiedlichen Ergebnissen, da diese Messungen entweder auf die gesamte oder nur auf die amplifizierbare DNA abzielen ctDNA-Freisetzung und in den meisten Studien verwirrende Ereignisse, die auch zur Freisetzung von ctDNA beitragen könnten. "
Gezielte und nicht zielgerichtete Ansätze
Derzeit gibt es zwei Hauptansätze für die Analyse von Blutplasma (oder Serum) auf ctDNA. Der erste Ansatz ist zielgerichtet und sucht nach spezifischen genetischen Veränderungen, die auf Tumore hinweisen. Der zweite Ansatz ist nicht zielgerichtet und beinhaltet eine genomweite Analyse auf der Suche nach krebsspiegelnder ctDNA. Alternativ wurde die Exomsequenzierung als kostengünstigerer, nicht zielgerichteter Ansatz eingesetzt. Exome sind die Teile der DNA, die transkribiert werden, um Protein herzustellen.Mit gezielten Ansätzen wird das Serum in einer kleinen Menge von Treibermutationen auf bekannte genetische Mutationen analysiert. Treibermutationen beziehen sich auf Mutationen im Genom, die das Wachstum von Krebszellen fördern oder "vorantreiben". Diese Mutationen umfassen KRAS oder EGFR.
Aufgrund der technologischen Fortschritte in den letzten Jahren sind gezielte Ansätze zur Analyse des Genoms auf geringe Mengen von ctDNA möglich geworden. Diese Technologien umfassen ARMS (Amplification Refractory Mutation System); digitale PCR (dPCR); Perlen, Emulsionen, Verstärkung und Magnete (BEAMing); und Deep Sequencing (CAPP-Seq).
Obwohl Fortschritte in der Technologie erzielt wurden, die den gezielten Ansatz ermöglichen, zielt der gezielte Ansatz nur auf wenige Positionen von Mutationen (Hotspots) ab und lässt viele Treibermutationen wie Tumorsuppressorgene aus.
Der Hauptvorteil von nicht zielgerichteten Ansätzen zur Flüssigkeitsbiopsie besteht darin, dass sie bei allen Patienten angewendet werden können, da der Test nicht auf wiederkehrenden genetischen Veränderungen beruht. Wiederkehrende genetische Veränderungen decken nicht alle Krebsarten ab und sind keine spezifischen Krebssignaturen. Trotzdem mangelt es diesem Ansatz an analytischer Sensitivität und eine umfassende Analyse des Tumorgenoms ist noch nicht möglich.
Bemerkenswerterweise ist der Preis für die Sequenzierung eines gesamten Genoms erheblich gesunken. Im Jahr 2006 lag der Preis für die Sequenzierung des gesamten Genoms bei ca. 300.000 USD. Bis 2017 waren die Kosten auf ca. 1.000 USD pro Genom gesunken, einschließlich Reagenzien und Amortisation von Sequenziergeräten.
Klinischer Nutzen der Flüssigkeitsbiopsie
Anfängliche Versuche, ctDNA zu verwenden, waren diagnostisch und verglichen die Spiegel bei gesunden Patienten mit denen von Krebspatienten oder solchen mit gutartigen Erkrankungen. Die Ergebnisse dieser Bemühungen waren gemischt, wobei nur einige Studien signifikante Unterschiede zeigten, die auf Krebs, krankheitsfreien Status oder Rückfall hindeuteten.Der Grund, warum ctDNA nur teilweise zur Diagnose von Krebs verwendet werden kann, liegt darin, dass variable Mengen an ctDNA aus Tumoren stammen. Nicht alle Tumoren "verschütten" DNA in der gleichen Menge. Allgemein setzen weiter fortgeschrittene, weit verbreitete Tumore mehr DNA in den Blutkreislauf frei als frühe, lokalisierte Tumore. Zusätzlich geben verschiedene Tumortypen unterschiedliche Mengen an DNA in den Kreislauf ab. Der Anteil der zirkulierenden DNA, der aus einem Tumor stammt, ist in Studien und Krebsarten sehr unterschiedlich und liegt zwischen 0,01% und 93%. Es ist wichtig zu beachten, dass im Allgemeinen nur eine Minderheit der ctDNA aus dem Tumor stammt, der Rest davon stammt aus normalen Geweben.
Zirkulierende DNA könnte als prognostischer Marker für Krankheiten verwendet werden. Zirkulierende DNA könnte verwendet werden, um Veränderungen von Krebs im Laufe der Zeit zu überwachen. Beispielsweise zeigte eine Studie, dass die Zwei-Jahres-Überlebensrate bei Patienten mit Darmkrebs (d. H. Die Anzahl der Patienten, die mindestens zwei Jahre nach der Diagnose mit Darmkrebs noch am Leben sind) und KRAS Hotspot-Mutationen waren zu 100 Prozent vorhanden, ohne dass entsprechende zirkulierende DNA nachgewiesen werden konnte. Darüber hinaus ist es möglich, dass in naher Zukunft zirkulierende DNA zur Überwachung von Präkanzerosen verwendet werden kann.
Zirkulierende DNA könnte auch verwendet werden, um das Ansprechen auf die Therapie zu überwachen. Da zirkulierende DNA ein besseres Gesamtbild des Erbguts von Tumoren liefert, enthält diese DNA wahrscheinlich diagnostische DNA, die anstelle von diagnostischer DNA verwendet werden kann, die von Tumoren selbst erhalten wird.
Betrachten wir nun einige spezifische Beispiele für die Flüssigbiopsie.
Guardant360
Guardant Health hat einen Test entwickelt, der Sequenzierung der nächsten Generation verwendet, um zirkulierende DNA auf Mutationen und chromosomale Umlagerungen für 73 krebsrelevante Gene zu untersuchen. Guardant Health veröffentlichte eine Studie, in der der Nutzen der Flüssigkeitsbiopsie in der Onkologie beschrieben wird. Die Studie verwendete Blutproben von 15.000 Patienten mit insgesamt 50 Tumorarten.Die Ergebnisse des Flüssigkeitsbiopsietests stimmten größtenteils mit den bei Tumorbiopsien beobachteten Genveränderungen überein.
Nach Angaben des NIH:
Guardant360 identifizierte die gleichen kritischen Mutationen in wichtigen krebsrelevanten Genen wie EGFR, BRAF, KRAS, und PIK3CA bei Frequenzen, die den zuvor in Tumor-Biopsieproben identifizierten Frequenzen sehr ähnlich sind und statistisch mit 94% bis 99% korrelieren. "
Darüber hinaus berichteten die Forscher laut NIH über Folgendes:
In einer zweiten Komponente der Studie bewerteten die Forscher fast 400 Patienten, von denen die meisten Lungen- oder Darmkrebs hatten, die sowohl Blut-ctDNA- als auch Tumorgewebe-DNA-Ergebnisse hatten, und verglichen die Muster genomischer Veränderungen. Die Gesamtgenauigkeit der Flüssigkeit Die Biopsie betrug im Vergleich zu den Ergebnissen der Tumorbiopsieanalysen 87%. Die Genauigkeit stieg auf 98%, wenn die Blut- und Tumorproben innerhalb von 6 Monaten voneinander entnommen wurden. "
Guardant360 war genau, obwohl die Menge an zirkulierender DNA im Blut niedrig war. Zirkulierende Tumor-DNA machte häufig nur 0,4 Prozent der DNA im Blut aus.
Insgesamt konnten die Guardant-Forscher mithilfe einer Flüssigkeitsbiopsie Tumormarker identifizieren, die bei 67 Prozent der Patienten eine direkte ärztliche Behandlung ermöglichen. Diese Patienten hatten Anspruch auf von der FDA zugelassene Behandlungen sowie auf Untersuchungstherapien.
ctDNA und Lungenkrebs
2016 genehmigte die FDA den cobas EGFR-Mutationstest zum Nachweis von EGFR Mutationen in der zirkulierenden DNA von Patienten mit Lungenkrebs. Dieser Test war die erste von der FDA genehmigte Flüssigkeitsbiopsie und identifizierte Patienten, die für eine Behandlung mit gezielten Therapien mit Erlotinib (Tarceva), Afatinib (Gilotrif) und Gefitinib (Iressa) als Erstbehandlung und Osimeritinib (Tagrisso) als Kandidaten in Frage kommen Second-Line-Behandlung. Diese gezielten Therapien greifen Krebszellen gezielt an EGFR Mutationen.Wichtig ist, dass die FDA aufgrund der hohen Anzahl falsch-negativer Ergebnisse empfiehlt, eine Gewebe-Biopsieprobe auch von einem Patienten zu entnehmen, der eine negative Flüssigkeitsbiopsie hat.
ctDNA und Leberkrebs
Die Zahl der Menschen, die an Leberkrebs sterben, hat in den letzten 20 Jahren zugenommen. Derzeit ist Leberkrebs die zweithäufigste Krebstodesursache weltweit. Es gibt keine guten Biomarker zum Nachweis und zur Analyse von Leber- oder Leberzellkrebs. Zirkulierende DNA könnte ein guter Biomarker für Leberkrebs sein.Betrachten Sie das folgende Zitat von Lagbaa und Mitautoren zum Potenzial der Verwendung von zirkulierender DNA zur Diagnose von Leberkrebs:
Die Hypermethylierung von RASSF1A, p15 und p16 wurde als frühes diagnostisches Instrument in einer retrospektiven Studie mit 50 HCC-Patienten vorgeschlagen. Eine Signatur von vier aberrant methylierten Genen (APC, GSTP1, RASSF1A und SFRP1) wurde ebenfalls auf diagnostische Genauigkeit getestet Die Methylierung von RASSF1A stellte einen prognostischen Biomarker dar. Nachfolgende Studien analysierten die ctDNA bei HCC-Patienten mithilfe von Deep-Sequencing-Technologien Dieser Befund öffnete die Tür, um die Variation der Kopienanzahl in ctDNA als Screening-Instrument für die Früherkennung von HCC zu bewerten.
Ein Wort von Verywell
Flüssigbiopsien sind ein aufregender neuer Ansatz für die Genomdiagnose. Gegenwärtig stehen Ärzten bestimmte Flüssigkeitsbiopsien zur Verfügung, die ein umfassendes molekulares Profiling ermöglichen, um die aus der Gewebebiopsie gewonnenen genetischen Informationen zu ergänzen. Es gibt auch bestimmte flüssige Biopsien, die anstelle von Gewebebiopsien verwendet werden können, wenn Gewebebiopsien nicht verfügbar sind.Es ist wichtig zu bedenken, dass derzeit viele Flüssigbiopsieversuche durchgeführt werden und weitere Forschungsarbeiten erforderlich sind, um den therapeutischen Nutzen dieser Intervention zu konkretisieren.
